 解析方法 | STSマーカー：
PCR増幅のための反応混合物の構成
液量20.0 μL中
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25ng 全ゲノムDNA
200mM 各dNTP（ベーリンガー･マンハイム社製）
20pmol プライマー（5'プライマー、3'プライマー）
2units Taq DNAポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）
PCRバッファ
10mM トリス（pH 8.3 at 25°C）
50mM 塩化カリウム（KCl）
0.001%(w/v) ゼラチン
40 mM 塩化マグネシウム（MgCl2）
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PCR増幅はGeneAmp PCR System 9600（パーキンエルマー社製）を使用し、94°C（1分）、60°C（1分）と72°C（2分）を35サイクル行い、最後のサイクルは72°Cを7分間で行いました。増幅したDNA産物は、120Vで2時間、0.5 x TBE緩衝液中の3.0%アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色しました。電気泳動分析の基準サイズマーカーには、λDNAを制限酵素HindIIIで完全分解したもの（λ/HindIII digest）とφX174DNAを制限酵素HaeIIIで完全分解したもの（φX174/HaeIII digest）の混合物を使用しました。
CAPSマーカー：
PCR増幅はGeneAmp PCR System 9600を使用し、94°C（1分）、60°C（2分）と72°C（3分）を30サイクル行い、最後のサイクルは72°Cを7分間で行いました。各プライマー対の増幅産物を28の制限酵素（PstI, HindIII, BamHI, EcoRI, ApaI, XhoI, KpnI, HaeIII, DraI, XbaI, SalI, EcoT14I, MspI, HinfI, EcoRV, BglII, SacI, HhaI, EcoT22I, HapII, ScaI, AfaI, MluI, PshBI, MboI, MvaI, SacII, HincII）で消化しました。いくつかのマーカーは、増幅産物をさらに14の制限酵素（AccII, AluI, AvaII, BcnI, Cfr13I, AccI, AvaI, BanII, Cfr10I, EaeI, HaeII, MflI, Bsp1286I, TthHB8I）で消化しました。消化された増幅産物を120Vで2時間、0.5 x TBE緩衝液中の2.0%アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色しました。
dCAPSプライマーを用いたPCR増幅は、CAPSマーカーを用いたのと同じ状態で行い、結果として得られた増幅産物を酵素で消化しました。消化された増幅産物を120Vで2時間、0.5 x TBE緩衝液中の4.0%アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色しました。 |
