解析方法
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STSマーカー:
PCR増幅のための反応混合物の構成
液量20.0 μL中
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25ng 全ゲノムDNA
200mM 各dNTP(ベーリンガー・マンハイム社製)
20pmol プライマー(5'プライマー、3'プライマー)
2units Taq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)
PCRバッファ
10mM トリス(pH 8.3 at 25°C)
50mM 塩化カリウム(KCl)
0.001%(w/v) ゼラチン
40 mM 塩化マグネシウム(MgCl2)
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PCR増幅はGeneAmp PCR System 9600(パーキンエルマー社製)を使用し、94°C(1分)、60°C(1分)と72°C(2分)を35サイクル行い、最後のサイクルは72°Cを7分間で行いました。増幅したDNA産物は、120Vで2時間、0.5 x TBE緩衝液中の3.0%アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色しました。電気泳動分析の基準サイズマーカーには、λDNAを制限酵素HindIIIで完全分解したもの(λ/HindIII digest)とφX174DNAを制限酵素HaeIIIで完全分解したもの(φX174/HaeIII digest)の混合物を使用しました。
CAPSマーカー:
PCR増幅はGeneAmp PCR System 9600を使用し、94°C(1分)、60°C(2分)と72°C(3分)を30サイクル行い、最後のサイクルは72°Cを7分間で行いました。各プライマー対の増幅産物を28の制限酵素(PstI, HindIII, BamHI, EcoRI, ApaI, XhoI, KpnI, HaeIII, DraI, XbaI, SalI, EcoT14I, MspI, HinfI, EcoRV, BglII, SacI, HhaI, EcoT22I, HapII, ScaI, AfaI, MluI, PshBI, MboI, MvaI, SacII, HincII)で消化しました。いくつかのマーカーは、増幅産物をさらに14の制限酵素(AccII, AluI, AvaII, BcnI, Cfr13I, AccI, AvaI, BanII, Cfr10I, EaeI, HaeII, MflI, Bsp1286I, TthHB8I)で消化しました。消化された増幅産物を120Vで2時間、0.5 x TBE緩衝液中の2.0%アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色しました。
dCAPSプライマーを用いたPCR増幅は、CAPSマーカーを用いたのと同じ状態で行い、結果として得られた増幅産物を酵素で消化しました。消化された増幅産物を120Vで2時間、0.5 x TBE緩衝液中の4.0%アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色しました。
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