スタンダードSDS-PAGE → クマシー染色脱色 → アラビアゴム乾燥

<スタンダードSDS-PAGE>
  1)1mmスペーサー付きガラス板(160×140×1mm)、シリコンチューブ、耳付きガラス板を組立て、
     大型クリップで4箇所を止め、実験台の上に立てる。
  2)100 mlビーカー中で分離ゲル溶液を調製する。
分離ゲルの組成

15%(1枚分)

分離ゲル用アクリルアミド溶液

分離ゲル用緩衝液

純水

10%過硫酸アンモニウム

TEMED

8.5 ml

6.3 ml

2.0 ml

120 µl

20 µl

泡立てないように撹拌し、組立てたガラス板の間に上から約3cmの高さまで注入する (10%過硫酸アンモニウムとTEMEDを入れるとすぐ固まるので素早く行う)。 3)約1mlの純水をピペットマン等で、ゲルに重層する。  4)室温で40分〜1時間放置して、ゲル化させる。  5)水をとりのぞく。 6) 100 mlビーカー中で濃縮ゲル溶液を調製する。 
濃縮ゲルの組成

5%(1枚分)

濃縮ゲル用アクリルアミド溶液

濃縮ゲル用緩衝液

純水

10%過硫酸アンモニウム

TEMED

1 ml

3 ml

2 ml

30 µl

20 µl

泡立てないように撹拌して、分離ゲルの上に重層し、コームを挿入する (10%過硫酸アンモニウムとTEMEDを入れるとすぐ固まるので素早く行う)。  7)室温で20分間放置する。  8)コームを抜き、クリップ、シリコンチューブをはずす。  9)試料溝の部分の未重合アクリルアミドを注射器等で除く。 10)ガラス板を泳動槽にセットして、泳動用緩衝液を満たす。 11) 試料用緩衝液に溶解し、95℃、3分間熱処理した試料を、マイクロシリンジや ピペットマンで試料溝に注入する。少量のBPB溶液(50μl)を陰極側電極槽(上層)に添加する。 12)35 mA(定電流)で、BPBがゲルの下部から約5mmのところへ移動するまで泳動する(約3時間)。 13)電流を切って、ガラス板を泳動槽から取りはずす。 14)スパチュラを用いて、耳付きガラス板をはずす。 15)分離ゲルと濃縮ゲルの間を切り、分離ゲルをクマシーブリリアントブルー染色液にて30分間染色する。 16)脱色液中で脱色する。 <アラビアゴム乾燥> 1)ゲル上のタンパク質を染色したのち、ゲルを水洗し、20%アラビアゴムに浸し1時間放置する。 2)セロファンを10%グリセリンに浸し、アクリル板上にのせる (セロファンとアクリル板の間の気泡をできるだけ除く)。 3)この上にゲルをのせ、少量の10%グリセリンをかける(ゲルとセロファンの間の気泡を完全に除く)。 4)その上に、気泡が入らないようにセロファンをかけ、アクリル板をのせてクリップで止める。 5)板を立てたまま、50℃・8時間以上乾燥器に入れる。 6) 乾燥したゲルはアクリル板からカッター等ではずす。