質量分析計解析のためのサンプル調整法

<試薬調整法> 使用する試薬 メタノール（MeOH）プロティンシーケンサー用 アセトニトリル（MeCN）HPLCグレード トリフルオロ酢酸（TFA）HPLCグレード ストックしておくもの 冷蔵（４℃） 　 100 mM NH４HCO３ 500 mM EDTA･2Na 　 洗浄液　（25％ MeOH ／7%　酢酸） 10 mM　Tris-HCl （pH8.0） 3% TFA 　 0.1％　TFA／100％　MeCN 　 0.1％　TFA／100％　H２O 冷凍（−20℃） 　 １M　Dithiothreitol（DTT） 　 10 pM トリプシン／10 mM　Tris-HCl 使用時作成するもの 脱色液（50mM NH４HCO３／50％　MeOH） 　100 mM NH４HCO３ 2.5ml 　100% MeOH 2.5ml 還元溶液（10mM EDTA･2Na／10mM DTT／100mM NH４HCO３） 　500 mM EDTA･2Na　　 20µl １M　DTT　　　　　　　10µl 　100 mM NH４HCO３　 　970µl アルキル化溶液（10mM EDTA･2Na／40mM ﾖｰﾄﾞｱｾﾄｱﾐﾄﾞ／100mM NH４HCO３） 　500 mM EDTA･2Na　　20µl 　ヨードアセトアミド　　　7.4 mg　　　　　　 　100 mM NH４HCO３　　 980µl トリプシン溶液 　10 pM トリプシン／10 mM　Tris-HCl　　 50µl 　10 mM　Tris-HCl （pH8.0）　　　　　　　450µl <サンプルの調整法> 　1) ゲルの切り出し 　　 二次元電気泳動後、染色・脱色したゲルから目的のタンパク質のスポットを切り出す。 ライトボックス上でスパチュラを用いて切り出しを行い、純水で洗浄後、 水分を除いてエッペンチューブに入れる。このまま冷凍保存可能（-20℃）。 あるいはスポットピッカーを使用。 (Fig.3) 　2) 洗浄・脱色 ゲルの入ったエッペンチューブに洗浄液（25％ MeOH／7% 酢酸）を1ml加え、 ローテーター上で室温にして一晩、振盪する。 脱色は染色法により、いずれかの方法で行う。 （CBB染色を行った場合） 　　 純水で洗浄後、脱色液（50 mM NH４HCO３／50% MeOH）を0.5 ml加え、 40℃のクールブロックでCBBが脱色されるまでインキュベートする（30分〜１時間）。 その後溶液を除去し、純水で洗浄する。 （銀染色を行った場合） 　 20 ｍM EDTA･２Na／50 mM Tris-HCl(pH8.0)／30% MeCNを0.3 ml加え、 室温で5分放置後、上澄み溶液を捨てる。これを2回行い、さらに純水で2回洗浄する。 3) 還元及びアルキル化 　(1) 減圧乾燥機によりゲルを乾燥する。（省略可能） 　(2) 還元溶液（10mM EDTA･2Na／10mM DTT／100mM NH４HCO３）を50μl加えてゲルを膨潤させ、 60℃のクールブロックで1時間インキュベートする。 　(3) 溶液を捨て、減圧乾燥機によりゲルを乾燥する。 　(4) アルキル化溶液（10mM EDTA･2Na／40mM ヨードアセトアミド／100mM NH４HCO３）を 50µl加えてゲルを膨潤させ、暗所・室温で30分反応させる。 　(5) 純水を1ml加え、ゲルを洗浄した後、水を除く。これを2回行う。 (6) ゲルをチップの先やペレッターなどで押しつぶし、細かくする。 (7) 減圧乾燥機によりゲルを乾燥する。 4) 酵素消化 (1) 酵素の量が全体で１pMとなるようにプロテアーゼ溶液を調整し、ゲルに加える。 ここでは10pMトリプシン／10mM Tris-HCl 500µlを50µl加える。 (2) チューブのふたをパラフィルムで密封し、37℃のクールブロックで10〜12時間酵素消化する。 5) 抽出 (1) 酵素消化後の液に0.1％ TFA／100% MeCN　100μlを加え、超音波洗浄機に10分間かける。 (2) 上澄み液を回収する。 (3) 0.1％ TFA／100％ H２O　100μlを加え、超音波に10分間かける。 (4) 上澄み液を回収する。 (5) 0.1％ TFA／50% MeCN　80μlを加え、超音波に10分間かける。 (6) 上澄み液を回収する。 (7) 0.1％ TFA／100% MeCN　100μlを加え、超音波に10分間かける。 (8) 上澄み液を回収する。 (9) 回収した上澄み液をまとめて減圧乾燥機によりアセトニトリル（MeCN）を減圧除去する。 完全には乾燥させず、20〜30μl残すようにする（ペプチド溶液）。 ここまでの一連の操作はロボットを使用すると便利である。 (Fig.4) 6) 脱塩 (1) 抽出したペプチド溶液を、逆相担体を用いて脱塩・濃縮する。 ZipTip C18(Millipore)をピペットマンに装着し、0.1％ TFA／50% MeCNを 10µl吸引、排出して洗浄する。これを3回繰り返す。 (2) 0.1％ TFA／100% H２O　を10µl吸引、排出を3回繰り返して洗浄、平衡化。 (3) 抽出したペプチド溶液を10µlずつ吸引、排出を繰り返してペプチドを吸着。 (4) 0.1％ TFA／100% H２O　を10µl吸引、排出を3回繰り返して洗浄、脱塩。 (5) 0.1％ TFA／50% MeCN　の吸引、排出によりペプチドを溶出させる。 その後の操作により下記のように液量が異なる。 <そのままVOYGER-RPにかける場合> 　 ２µl吸引し、サンプルプレート上に載せる。そこにマトリックス液（後述）を ２µl加え、プレート上で混ぜる。その後風乾し測定にかける。 　　 <その他の質量分析計にかける場合> 　　　 必要液量を吸引し、チューブに排出する。 　　 <一時保存の場合> 　　 　５µl吸引し、エッペンドルフチューブに排出して冷凍保存する（-20℃）。 　　 　(Fig.5-1, Fig.5-2), <マトリックスの調整法> 　１）マトリックスの選択 サンプルの分子量に応じてマトリックス（Matrix）を選択する。 　　　　10 kDa以上　　　　 CHCA（α-Cyano-4-Hydoroxycinnamic Acid） 　　　　10 kDa以下　　　 　SA（Sinapinic Acid） 　２）調整 　 使用直前に調整する。下記の試薬を混合し、Vortexに１分間かける。 10分静置後、上澄みを使用する（完全には溶解しない）。 　　　　CHCA（あるいは SA）　 10 mg 　　3% TFA 100µl 　　　　MeCN　　　　　　　　　500µl 　　　　H２O　　　　　　　　　400µl