質量分析計解析のためのサンプル調整法
<試薬調整法> 使用する試薬 メタノール(MeOH)プロティンシーケンサー用 アセトニトリル(MeCN)HPLCグレード トリフルオロ酢酸(TFA)HPLCグレード ストックしておくもの 冷蔵(4℃) 100 mM NH4HCO3 500 mM EDTA・2Na 洗浄液 (25% MeOH /7% 酢酸) 10 mM Tris-HCl (pH8.0) 3% TFA 0.1% TFA/100% MeCN 0.1% TFA/100% H2O 冷凍(−20℃) 1M Dithiothreitol(DTT) 10 pM トリプシン/10 mM Tris-HCl 使用時作成するもの 脱色液(50mM NH4HCO3/50% MeOH) 100 mM NH4HCO3 2.5ml 100% MeOH 2.5ml 還元溶液(10mM EDTA・2Na/10mM DTT/100mM NH4HCO3) 500 mM EDTA・2Na 20µl 1M DTT 10µl 100 mM NH4HCO3 970µl アルキル化溶液(10mM EDTA・2Na/40mM ヨードアセトアミド/100mM NH4HCO3) 500 mM EDTA・2Na 20µl ヨードアセトアミド 7.4 mg 100 mM NH4HCO3 980µl トリプシン溶液 10 pM トリプシン/10 mM Tris-HCl 50µl 10 mM Tris-HCl (pH8.0) 450µl <サンプルの調整法> 1) ゲルの切り出し 二次元電気泳動後、染色・脱色したゲルから目的のタンパク質のスポットを切り出す。 ライトボックス上でスパチュラを用いて切り出しを行い、純水で洗浄後、 水分を除いてエッペンチューブに入れる。このまま冷凍保存可能(-20℃)。 あるいはスポットピッカーを使用。 (Fig.3) 2) 洗浄・脱色 ゲルの入ったエッペンチューブに洗浄液(25% MeOH/7% 酢酸)を1ml加え、 ローテーター上で室温にして一晩、振盪する。 脱色は染色法により、いずれかの方法で行う。 (CBB染色を行った場合) 純水で洗浄後、脱色液(50 mM NH4HCO3/50% MeOH)を0.5 ml加え、 40℃のクールブロックでCBBが脱色されるまでインキュベートする(30分〜1時間)。 その後溶液を除去し、純水で洗浄する。 (銀染色を行った場合) 20 mM EDTA・2Na/50 mM Tris-HCl(pH8.0)/30% MeCNを0.3 ml加え、 室温で5分放置後、上澄み溶液を捨てる。これを2回行い、さらに純水で2回洗浄する。 3) 還元及びアルキル化 (1) 減圧乾燥機によりゲルを乾燥する。(省略可能) (2) 還元溶液(10mM EDTA・2Na/10mM DTT/100mM NH4HCO3)を50μl加えてゲルを膨潤させ、 60℃のクールブロックで1時間インキュベートする。 (3) 溶液を捨て、減圧乾燥機によりゲルを乾燥する。 (4) アルキル化溶液(10mM EDTA・2Na/40mM ヨードアセトアミド/100mM NH4HCO3)を 50µl加えてゲルを膨潤させ、暗所・室温で30分反応させる。 (5) 純水を1ml加え、ゲルを洗浄した後、水を除く。これを2回行う。 (6) ゲルをチップの先やペレッターなどで押しつぶし、細かくする。 (7) 減圧乾燥機によりゲルを乾燥する。 4) 酵素消化 (1) 酵素の量が全体で1pMとなるようにプロテアーゼ溶液を調整し、ゲルに加える。 ここでは10pMトリプシン/10mM Tris-HCl 500µlを50µl加える。 (2) チューブのふたをパラフィルムで密封し、37℃のクールブロックで10〜12時間酵素消化する。 5) 抽出 (1) 酵素消化後の液に0.1% TFA/100% MeCN 100μlを加え、超音波洗浄機に10分間かける。 (2) 上澄み液を回収する。 (3) 0.1% TFA/100% H2O 100μlを加え、超音波に10分間かける。 (4) 上澄み液を回収する。 (5) 0.1% TFA/50% MeCN 80μlを加え、超音波に10分間かける。 (6) 上澄み液を回収する。 (7) 0.1% TFA/100% MeCN 100μlを加え、超音波に10分間かける。 (8) 上澄み液を回収する。 (9) 回収した上澄み液をまとめて減圧乾燥機によりアセトニトリル(MeCN)を減圧除去する。 完全には乾燥させず、20〜30μl残すようにする(ペプチド溶液)。 ここまでの一連の操作はロボットを使用すると便利である。 (Fig.4) 6) 脱塩 (1) 抽出したペプチド溶液を、逆相担体を用いて脱塩・濃縮する。 ZipTip C18(Millipore)をピペットマンに装着し、0.1% TFA/50% MeCNを 10µl吸引、排出して洗浄する。これを3回繰り返す。 (2) 0.1% TFA/100% H2O を10µl吸引、排出を3回繰り返して洗浄、平衡化。 (3) 抽出したペプチド溶液を10µlずつ吸引、排出を繰り返してペプチドを吸着。 (4) 0.1% TFA/100% H2O を10µl吸引、排出を3回繰り返して洗浄、脱塩。 (5) 0.1% TFA/50% MeCN の吸引、排出によりペプチドを溶出させる。 その後の操作により下記のように液量が異なる。 <そのままVOYGER-RPにかける場合> 2µl吸引し、サンプルプレート上に載せる。そこにマトリックス液(後述)を 2µl加え、プレート上で混ぜる。その後風乾し測定にかける。 <その他の質量分析計にかける場合> 必要液量を吸引し、チューブに排出する。 <一時保存の場合> 5µl吸引し、エッペンドルフチューブに排出して冷凍保存する(-20℃)。 (Fig.5-1, Fig.5-2), <マトリックスの調整法> 1)マトリックスの選択 サンプルの分子量に応じてマトリックス(Matrix)を選択する。 10 kDa以上 CHCA(α-Cyano-4-Hydoroxycinnamic Acid) 10 kDa以下 SA(Sinapinic Acid) 2)調整 使用直前に調整する。下記の試薬を混合し、Vortexに1分間かける。 10分静置後、上澄みを使用する(完全には溶解しない)。 CHCA(あるいは SA) 10 mg 3% TFA 100µl MeCN 500µl H2O 400µl
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