等電点電気泳動 → クマシー染色脱色 → アラビアゴム乾燥

<等電点電気泳動>
  1)1mmスペ−サ−付きガラス板(160×140×1mm)、シリコンチュ−ブ、
     耳付きガラ ス板を組立て、大型クリップで4箇所を止め、実験台の上に立てる。
  2)100 mlビ−カ−中でゲル溶液を調整する。
分離ゲルの組成

(1枚分)

尿素

1次元目用アクリルアミド溶液

純水

10%NP〜40
ここまで加えた後、ビーカーを温めて尿素を溶かす。
アンフォライン(ph 3.5〜10)

アンフォライン(ph 5〜8)

10%過硫酸アンモニウム

TEMED

12.0 g

3.6 ml

2.4 ml

4.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

140 µl

34 µl

  泡立てないように撹拌し、組み立てたガラス板の間に注入し、コ−ムを挿入する (10%過硫酸アンモニウムとTEMEDを入れるとすぐ固まるので素早く行う)。  3) 純水を満たす。  4)室温で40分〜1時間放置して、ゲル化させる。 5)コームを抜き、クリップ・シリコンチューブをはずす。 6)試料溝に残る水分を注射器で除きガラス板を泳動槽にセットする。 7)Lysis 緩衝液に溶解した試料を試料溝に注入する。 8)1/2 Lysis緩衝液を20μl重層する。 9)下層の陽極側に0.02 Nリン酸、上槽の陰極側に0.02 N水酸化ナトリウムを満たす。 10)ゲル1枚あたり、200 Vでオーバーナイトで泳動する。 11)電流を切って、ガラス板を泳動槽から取りはずす。 12)スパチュラを用いて、耳付きガラス板をはずし、試料用緩衝液にて15分間振とうする。 13)クマシーブリリアントブルー染色液にて30分間染色する。 14) 脱色液にて脱色する。 <アラビアゴム乾燥> 1)ゲル上のタンパク質を染色したのち、ゲルを水洗し、20%アラビアゴムに浸し1時間放置する。 2)セロファンを10%グリセリンに浸し、アクリル板上にのせる (セロファンとアクリル板の間の気泡をできるだけ除く)。 3)この上にゲルをのせ、少量の10%グリセリンをかける (ゲルとセロファンの間の気泡を完全に除く)。 4)その上に、気泡が入らないようにセロファンをかけ、アクリル板をのせてクリップで止める。 5)板を立てたまま、50℃・8時間以上乾燥器に入れる。 6) 乾燥したゲルはアクリル板からカッター等ではずす。