<IPG電気泳動>
1)IPGチューブゲル(第一化学:pI6〜10酸性側アプライ用11cmゲル)上に残る水
分を注射器で除き、ガラス管を等電点電気泳動装置にセットする。
2)Lysis 緩衝液に溶解した試料をゲル上に注入する。
3)1/2 Lysis 緩衝液を20µl重層し、さらに0.02Nリン酸を重層する。
4)下槽の陰極側に0.02N水酸化ナトリウム、上槽の陽極側に0.02Nリン酸を満たす。
5) 400V(定電圧)で1時間、1000V(定電圧)で16時間、2000V(定電圧)で1時間泳動する。
6)丸めたパラフィルムをガラス管上部につめて竹串でゆっくりと押しだし、
ゲルを試料用緩衝液約5mlの入った小バイアル瓶(10ml用)に入れる。
7) 15分間振とうし平衡化する。
8) 液を交換して、さらに15分間振とうし平衡化する。
<二次元目SDS-PAGE>
9) 100mlビーカー中で二次元目分離ゲル溶液を調整する。
分離ゲルの組成 |
15%(1枚分) |
分離ゲル用アクリルアミド溶液
分離ゲル用緩衝液
純水
10%過硫酸アンモニウム
TEMED
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8.5 ml
6.3 ml
2.0 ml
120 µl
20 µl
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泡立てないように撹拌し、組み立てたガラス板の間に上から約2cmの高さまで注入
する(10%過硫酸アンモニウムとTEMEDを入れるとすぐ固まるので素早く行う)。
10)約1mlの純水をゲルに重層する。
11)室温で40分〜1時間放置して、ゲル化させる。
12) 水をとりのぞく。
13)100 mlビーカー中で濃縮ゲル溶液を調製する。
濃縮ゲルの組成 |
5%(1枚分) |
濃縮ゲル用アクリルアミド溶液
濃縮ゲル用緩衝液
純水
10%過硫酸アンモニウム
TEMED
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1 ml
3 ml
2 ml
30 µl
20 µl
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泡立てないように攪拌し、分離ゲルの上に重層する(10%過硫酸アンモニウムと
TEMEDを入れるとすぐ固まるので素早く行う)。
14)室温で20分間放置する。
15)1%アガロースを電子レンジで加熱して溶解する。
16)濃縮ゲルの上にアガロース溶液を加え、アクリル板を用いて、
そこに平衡化した一次元目のゲルを静かに気泡が入らないようにのせる。
17)ガラス板を泳動槽にセットして、泳動用緩衝液を満たす。
18)35 mA(定電流)で泳動を開始して、BPBが濃縮ゲルの下端に近づいたところで
電流をいったん切り、アガロースとチューブゲルを取り除く。
19)再度泳動を35 mA(定電流)で開始し、BPBがゲルの下部から約5 mmのところへ
移動するまで泳動する(約3時間)。
20) 電源を切って、ガラス板を泳動槽から取りはずす。
21) スパチュラを用いて、耳付きガラス板をはずす。
22)分離ゲルと濃縮ゲルの間を切り、分離ゲルを染色し、乾燥する。
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