〈タイトル〉ムスクの香りを感知する嗅覚受容体と脳領域の同定

〈著 者〉白須未香・東原和成
〈著者所属〉東京大学大学院農学生命科学研究科 生物化学研究室
〈著者email〉mikashirasu@yahoo.co.jp（白須未香）

〈対象論文〉
Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors.
Mika Shirasu, Keiichi Yoshikawa, Yoshiki Takai, Ai Nakashima, Haruki Takeuchi, Hitoshi Sakano, Kazushige Touhara
Neuron, 81, 165-178 (2014)

〈要 約〉
　われわれにとって香りは生活の質を高める重要な要素のひとつである．なかでも，ムスク系の香りはほかの香料では表現できない官能的な香気をもつため，香水や柔軟剤など生活用品に広く用いられている．ムスク系の香りの代表ともいえるムスコンという匂い物質は，もともと雄のジャコウジカの臭腺から発見され，雄が雌を呼び寄せるシグナルとして使われている．また，ムスコンにはヒトに対する生理作用も報告されており，動物種をこえてフェロモン様の作用をもつという興味深い性質がある．では，ムスコンの匂いはどのように認識されているだろうか？　今回，筆者らは，ムスコンはマウスに約1000種類が存在する嗅覚受容体のうち，ほかの匂いと比べてきわめて少数の嗅覚受容体により受容されること，また，その匂い情報は嗅覚の一次中枢である嗅球のきわめて限局された特定の領域に入力されて高次脳へと伝達されることを明らかにした．さらに，マウスおよびヒトにおいて，ムスコンを受容する嗅覚受容体の同定にも成功した．この研究が，ながらく未知であったムスク系香料の認識機構の謎を解く鍵になることが期待される．

はじめに
　匂い物質は分子量300程度までの揮発性の低分子化合物であり，自然界には数十万種類が存在するといわれている．そして，匂いの質は，その分子のもつ官能基，炭素数，不飽和度などにより，ある程度は決まっている．しかし，まったく異なる構造をもつにもかかわらず匂いの質が似ているものや，光学異性体どうしで匂いの質が異なるものが存在するなど，分子の構造と匂いの質との関係は完全には解明されていない．一方，匂い物質はGタンパク質共役受容体である嗅覚受容体により受容されるが，この嗅覚受容体をコードする遺伝子はマウスとヒトの染色体にそれぞれ1063個と396個あることが知られている．この10年ほどで，ひとつひとつの嗅覚受容体がどの匂い物質（匂いリガンド）を受容するのかという研究が進み，嗅覚受容体と匂い物質は複数対複数の組合せにより受容されることが明らかになった1)．しかし，いまだ全体の数十％ほどの嗅覚受容体において匂いリガンドが同定されているだけで，今回，筆者らが注目した，ムスク系香料を受容する嗅覚受容体は未知であった2)．

1．ムスクの香りとは？
　動物はさまざまな体臭を発するが，その大半はヒトにとって不快な匂いである．しかし，なかにはよい香りを放つ動物がいる．たとえば，ヒマラヤ山脈などの山岳地帯に住むジャコウジカ（麝香鹿）の場合，雄の鼠頸部に左右1対，中央に穴をもつ腺があり，ここに分泌物（麝香，ムスク）がたまると体外へと放出される．この分泌物は非常にすぐれた香気を放つため，紀元前のインドおよび中国ですでに身にまとう香りとして重用されていた．本来，"ムスク"はジャコウジカの分泌物をさす言葉であったが，転じて，ムスク様の香りをもつものの総称となっている．1926年，ジャコウジカの分泌物の主要な香気成分が分子量238の大環状ケトン構造をもつことが発見され，ムスコンと名づけられた3)（図1）．そののち，ジャコウネコ（麝香猫），マスクラット，スンクス（麝香鼠）の分泌物からも，共通したムスク様の香気をもつ化合物が同定された．これらはすべて炭素数15〜17の大環状ケトンとよばれる共通の構造をもつ匂い物質である．これらの物質の体内における生合成経路は未知であるが，おそらく，長鎖脂肪酸に由来すると推測されている．これらの匂い物質は分泌している動物にとりどのような意味をもつのだろうか．ジャコウジカの場合は，雄が発情期になると臭腺から出るこの匂いにより自分のテリトリーを示し雌を呼び寄せるフェロモン様の作用をもつといわれる．また，ムスコンはヒトに対し性ホルモンの量の変化を誘発するなどの生理作用をもつという報告もある．
　さて，ムスコンの香りは，香調を表現する用語でムスキー（Musky，動物臭および温かみがあり肉感的で艶っぽい香調）とよばれ，ほかの香料にはない官能的な匂いをもつ．しかし，ジャコウジカなどの捕獲が禁止されている現在，天然のムスコンを採取し香料として用いることはできない．このような背景から，ムスコンの香気を模したムスク系香料とよばれる数百種類もの合成香料がつくりだされてきた4)（図1）．ムスク系香料と称される化合物の匂いの質は非常によく似ているが，その構造は驚くほど異なっている．現代では，工業的に合成された多種多様なムスク系香料がフレグランスから洗剤にいたるまで多くの香粧品に用いられており，この香りを嗅がない日はないといっても過言ではない．
　このようにムスク系香料は興味深い性質をもつため，嗅覚系において，何種類くらいの嗅覚受容体により，どのような分子機構で認識され，脳のどの部分に情報が伝達されるのか，生物学的にもたいへん興味がもたれていた．そこで，筆者らは，ムスコンの嗅覚受容体を同定し，ムスク系香料の嗅覚神経系における情報処理の機構を解明することをめざした．

2．マウスを用いたムスコンに対する匂い応答イメージング
　研究には，モデル動物であるマウスを用いた．マウスの場合，同一の嗅覚受容体を発現する嗅神経細胞は，嗅覚一次中枢である嗅球の表層に存在する約2000個の糸球体のうち，特定の場所に位置する数個の糸球体に軸索を収束して投射する．そのため，嗅上皮にある嗅神経細胞における匂いリガンドと嗅覚受容体との結合は，嗅球において糸球体の活性化のパターンとして観察できる．この性質を利用して，嗅球においてムスコンに応答する糸球体を探索した．この研究では，嗅球における匂い応答イメージングのため開発されたトランスジェニックマウスであるspHマウスを用いた5)．spHマウスは，神経活動にともない発光強度の変化するGFP改変タンパク質（spH）を，嗅神経細胞の末端のシナプス小胞に発現させたノックインマウスである．このマウスでは，匂い刺激にともなう嗅神経細胞の活動を嗅球においてin vivoでモニターすることができる．匂い応答イメージングの際には，頭部を自由に回転できるよう設計した特注の固定器に麻酔したマウスを固定したのち，頭部を開き嗅球を露出させる手術を行った6)．
　測定手法の確立されている背側領域および外側領域において，ムスコンを含むさまざまな匂いに対する応答を測定した．その結果，嗅球の背側領域や外側領域ではオイゲノール，ヘキサナール，ベンゼンに対し応答する10〜40個の糸球体が観察された．しかし，ムスコンに応答する糸球体はこれらの領域には存在しなかった．そこで，従来の手法では匂い応答の測定が不可能であった左右の嗅球が接する内側領域を観察するため，片側の嗅球を物理的に吸い取り，内側領域の表面を可視化する手法を確立した．この手法を用いたところ，嗅球の内側前部にある約1〜3個の糸球体のみがムスコンに対し応答を示すことがわかった（図2）．

3．自由行動しているマウスにおけるムスコンに対する匂い応答の解析
　さきに述べた手法を取り入れたことにより，嗅球の広い範囲にわたる匂い応答イメージングが可能になった．しかし，嗅球には最腹側領域のように物理的に観察できない部位がわずかに残されており，これらの領域を網羅する匂い応答の解析を行う必要があった．また，匂い応答イメージングは麻酔した状態で行われるので，麻酔下と自由行動下（無麻酔下）の嗅球におけるムスコンの認識機構に違いのないことも確かめたいと考えた．そこで，初期応答遺伝子であるc-fos遺伝子の匂い刺激による嗅球における発現の誘導を指標とした匂い応答の解析（c-Fosアッセイ）を，自由行動しているマウスにおいて行った．匂い刺激にともない，嗅神経細胞から興奮性の入力をうけた糸球体の周辺の傍糸球体細胞，僧帽細胞，顆粒細胞などのニューロンでは，c-Fosの発現が誘導される．とくに，傍糸球体細胞は糸球体をかこむように存在するため，匂い刺激に応答した糸球体の位置を明確に知ることができる．
　自由行動しているマウスに1分間ムスコンの匂いを呈示し，70分後に還流固定しc-Fosの免疫組織化学染色を行った．その結果，匂い応答イメージングによりムスコンに応答する糸球体が観察された領域，つまり，嗅球の内側前部に，ムスコンの刺激によりc-Fosの発現が誘導された1〜3個の糸球体の存在することがわかった（図2）．なお，c-Fosアッセイを行ったうち複数の個体において，匂い応答イメージングでは観察できない嗅球の前方腹側領域の1〜2個の糸球体においてc-Fosの発現が誘導された．さらに，ムスコンに応答した糸球体の含まれる嗅球の前方領域を外科的に破壊したマウスは，ムスコンを感知できなくなる"ムスコン嗅盲（ムスコンの匂いを嗅げない）マウス"になった．これらの結果を総合すると，マウスはムスコンを非常に少数の糸球体，つまり，少数の嗅覚受容体により受容していることが示唆された．一般的に，ひとつの匂い物質は数十種類以上の嗅覚受容体により受容されるため，ムスコンに応答する嗅覚受容体の数はほかの匂いの場合と比較して非常に少ないといえた．

4．嗅球におけるさまざまなムスク系香料の匂い応答の解析
　嗅球における匂い応答イメージングにより，ムスコンに応答する糸球体における，さまざまなムスク系香料に対する匂い応答の構造活性相関について調べた．その結果，ムスコンに応答する糸球体は炭素数15あるいは16の大環状ケトン構造をもつムスク系香料のみに応答を示し，ほかのムスク系香料には応答を示さなかった．また，環の炭素数の少ない六員環ケトンや，ケトン基がアルコール基に変化した大環状アルコール，官能基のない大環状炭化水素，などの構造の類似した化合物には応答を示さなかった．以上の結果から，マウスのムスコンに応答する糸球体に発現する嗅覚受容体は，大環状ケトンムスクに対し選択性を示すことがわかった．つぎに，c-Fosアッセイにより，ほかのムスク系香料に応答する糸球体を探索した．興味深いことに，ムスコンとはまったく異なる化学構造をもつニトロムスク，多環式ムスク，大環状エステルも，ムスコンに応答する糸球体と同様に，嗅球の内側前方領域の少数の糸球体により受容されていた．ムスク系の香り全体を象徴する動物的かつ官能的な香調は，嗅球の内側前部という特定の領域の活性化により生み出されているのかもしれない．

5．マウスおよびヒトにおけるムスコンに応答する嗅覚受容体の同定
　以上の結果から，マウスはムスコンを少数の選択性の高い嗅覚受容体により受容していることが明らかになった．そこで，この嗅覚受容体を同定するため，ムスコンに応答する糸球体に逆行性の神経トレーサーである蛍光色素，オクタデシルインドカルボシアニンを圧注入し，糸球体に投射する嗅神経細胞の細胞体を標識した．標識されたオクタデシルインドカルボシアニン陽性細胞を単離し，嗅覚受容体遺伝子ファミリーからデザインされた縮重プライマーを用いたRT-PCR法により遺伝子の増幅を行った7-9)．その結果，ムスコンに応答する糸球体に投射する嗅神経細胞において発現する，嗅覚受容体遺伝子の候補としてMOR215-1遺伝子が得られた．MOR215-1を匂い応答のin vitro再構成系としてよく用いられるアフリカツメガエル卵母細胞やHEK293培養細胞において発現させたところ，ムスコンに応答を示した．
　このMOR215-1がin vivoの系，つまり，生体のマウスにおいてムスコンの認識にかかわるのか，また，MOR215-1以外にもムスコンを受容する嗅覚受容体が存在するのか確かめるため，MOR215-1を発現する嗅神経細胞，および，その投射先の糸球体がGFPにより標識されるノックインマウスを作製した．このマウスにおいてGFP陽性の糸球体は，さきのc-Fosアッセイにおいてムスコンの刺激によりc-Fosの発現が誘導された領域に，同じく嗅球の内側と腹側にあわせて1〜3個が存在した（図2）．そこで，このノックインマウスにムスコンの刺激をあたえてc-Fosアッセイを行ったところ，GFP陽性のMOR215-1を発現する糸球体の周辺においてc-Fosの発現が誘導された．なお，実験を行ったうち約半数のマウスでは，MOR215-1の近傍に，GFP陰性（MOR215-1以外の嗅覚受容体を発現する細胞が投射している）であるがc-Fosの発現が誘導された糸球体が存在した．これらの知見を総合すると，ムスコンの匂いシグナルは，MOR215-1を含めたせいぜい数種類の嗅覚受容体を介して脳に伝達され感知されていることが示唆された．
　また，ヒトにおいても，ムスコンを受容する嗅覚受容体の探索を試みた．その結果，MOR215-1のアミノ酸配列にもっとも類似したアミノ酸配列をもつヒトの嗅覚受容体OR5AN1が，MOR215-1と同様にムスコンに応答することが示された．

6．ムスコンを受容する嗅覚受容体における匂い応答の構造活性相関
　それでは，今回，同定されたムスコンを受容する嗅覚受容体は，さまざまな匂い物質に対しどのような構造活性相関を示すのだろうか？　MOR215-1を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞に，さまざまなムスク系香料や，ムスコンの構造類似物，アミン，アルコール，アルデヒド，酸，エステル，ラクトンなど，ほかの種類の香料の刺激を呈示し，嗅覚受容体と匂い物質との構造活性相関を調べた．その結果，嗅球における匂い応答イメージングと同様に，MOR215-1は大環状ケトン構造をもつムスク系香料を選択的に受容した．ところで，ムスコンには鏡像異性体の存在することが知られている．ヒトの官能評価によるとその匂いの質は，l体が"拡散性にすぐれたボリューム感ある強いムスク香"と表現されるのに対し，d体は"広がりのない貧弱な弱いムスク香"とされており，匂い閾値（その匂い物質の匂いを嗅ぐことができる最低濃度）もl体のほうが低い．ムスコンの鏡像異性体に対するMOR215-1の応答について調べると，l体に対する感度はd体に対する感度よりも100倍ほど高かった．なお，ジャコウジカの臭腺，つまり，天然に存在するムスコンはすべてl体であり，嗅覚受容体が天然に由来するl体に対し高感度であるという事実は，生態の環境に実在する匂い情報を効率よく取得するため理にかなっているといえる．

おわりに
　最初のムスコンの化学構造の解明においては，九員環ケトンから二十員環ケトンまですべてが合成されその匂いが評価された3)．約1世紀もまえに報告されたその文献によると，小さい環は樟脳の香り，炭素数10〜13ではウッディな香り，炭素数14個あたりからムスク香が現われ，20個になると無臭になるという．つまり，ヒトの官能評価によれば，環状ケトンがムスコン様の香りをもつためには，環の大きさが重要なポイントであることがわかる．今回，同定されたマウスおよびヒトのムスコンを受容する嗅覚受容体の構造活性相関は，まさに，この官能評価のとおりであった．つまり，マウスだけでなく，ヒトでもまた，OR5AN1を含む非常に少数の嗅覚受容体により大環状ケトン構造をもつムスコンを認識しているのではないだろうか．実際に，ヒトの約6％はムスコンに対し特異的な嗅盲であることも知られており，筆者らは，この嗅盲現象をOR5AN1を含む嗅覚受容体の遺伝子多型により説明できるのではないかと考えている．また，MOR215-1やOR5AN1は生分解性にすぐれ産業界でも重用されている大環状ケトン構造をもつムスク香料をよく受容し，ほかの種類の香料には応答を示さない．これらのムスコンを受容する嗅覚受容体の匂い応答の特性を利用した香料スクリーニング系を利用することにより，産業的に有用なムスク系香料の新規の開発にもつながると期待される．

〈文 献〉
 1) Touhara, K. & Vosshall, L. B.: Sensing odorants and pheromones with chemosensory receptors. Annu. Rev. Physiol., 71, 307-332 (2009)
 2) Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W. et al.: RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell, 119, 679-691 (2004)
 3) Ruzicka, L., Stoll, M. & Schinz, H.: Zur Kenntnis des Kohlenstoffringes II. Synthese der carbocyclischen Ketone vom Zehner- bis zum Achtzehnerring. Helv. Chim. Acta, 9, 249-264 (1926)
 4) Matsuda, H., Watanabe, S. & Yamamoto, K.: New macrocyclic musk compounds. Chem. Biodivers., 1, 1985-1991 (2004)
 5) Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P. et al.: In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron 42, 9-21 (2004)
 6) Igarashi, K. M. & Mori, K.: Spatial representation of hydrocarbon odorants in the ventrolateral zones of the rat olfactory bulb. J. Neurophysiol., 93, 1007-1019 (2005)
 7) Malnic, B., Hirono, J., Sato, T. et al.: Combinatorial receptor codes for odors. Cell, 96, 713-723 (1999)
 8) Oka, Y., Katada, S., Omura, M. et al.: Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron, 52, 857-869 (2006)
 9) Touhara, K., Sengoku, S., Inaki, K. et al.: Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4040-4045 (1999)

〈著者プロフィール〉
白須 未香（Mika Shirasu）
略歴：2009年 東京大学大学院新領域創成科学研究科 修了，同 博士研究員を経て，2013年より東京大学大学院農学生命科学研究科 特任助教．
研究テーマ：体臭の生合成経路の探索，および，その受容の機構．
関心事：嗅感覚を利用したアート活動，香道．

東原 和成（Kazushige Touhara）
東京大学大学院農学生命科学研究科 教授．
研究室URL：http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/biological-chemistry/

〈図説明〉
図1　ムスク系香料の化学構造
図2　嗅球におけるムスコンに応答する糸球体の位置
内側は左右の嗅球が接している領域である．ここをイメージングするためには，右の嗅球を除去し，左の嗅球の表面（ピンク色）を露出させる必要がある．また，ムスコンに応答した糸球体の位置（A，B）を示した．匂い応答イメージングでは，内側に位置するAの糸球体のムスコンに対する応答が観察できる．一方，c-Fosアッセイでは，AとBの両方に位置する糸球体においてムスコンに対する応答が確認できる．どちらの糸球体にもMOR215-1を発現する嗅神経細胞が収束して投射している．