〈タイトル〉extendedシナプトタグミンによるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸およびCa2+に依存的な小胞体と細胞膜との接着部位の制御

〈著 者〉佐伯恭範・Pietro De Camilli
〈著者所属〉米国Yale School of Medicine，Department of Cell Biology
〈著者email〉yasunori.saheki@yale.edu（佐伯恭範）

〈対象論文〉
PI(4,5)P2-dependent and Ca2+-regulated ER-PM interactions mediated by the extended synaptotagmins.
Francesca Giordano, Yasunori Saheki, Olof Idevall-Hagren, Sara Francesca Colombo, Michelle Pirruccello, Ira Milosevic, Elena O. Gracheva, Sviatoslav N. Bagriantsev, Nica Borgese, Pietro De Camilli
Cell, 153, 1494-1509 (2013)

〈要 約〉
　高等真核生物において，小胞体と細胞膜との接着部位に関してはCa2+の制御における役割がもっともくわしく研究されてきている．しかしながら，近年，この小胞体-細胞膜接着部位がより一般的な機能をもつことが示されており，すべての細胞に普遍的に存在するアンカータンパク質の存在が示唆されていた．筆者らは，シナプトタグミンスーパーファミリーに属するextendedシナプトタグミン，E-Syt1，E-Syt2，E-Syt3が小胞体に局在し，小胞体-細胞膜接着部位におけるアンカータンパク質として機能していることをつきとめた．E-Syt2とE-Syt3はそのC2ドメインを介して細胞膜に豊富に存在するリン脂質であるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸に依存的に，そして，E-Syt1はそれにくわえ細胞内のCa2+濃度の上昇に依存的に，小胞体-細胞膜接着部位を形成していた．E-Syt1，E-Syt2，E-Syt3は互いにホモ複合体あるいはヘテロ複合体を形成して機能するため，extendedシナプトタグミンによる小胞体-細胞膜接着部位の形成は細胞内のCa2+により制御されていた．しかしながら，extendedシナプトタグミンにより形成される小胞体-細胞膜接着部位はストア作動性のCa2+流入には必要でなかった．これらのことから，extendedシナプトタグミンのもつアンカータンパク質としての機能により形成される小胞体-細胞膜接着部位は，STIM1とOrai1により形成されストア作動性のCa2+流入に重要な役割をはたす小胞体-細胞膜接着部位とは異なる機能をもつことが明らかになった．

はじめに
　小胞体は細胞においてさまざまな機能をもっている．もっともよく知られている機能としてタンパク質の生合成やCa2+の貯蔵があげられるが，脂質の生合成においても重要な役割をはたしている．小胞体はあらゆる方向に伸長し，小胞輸送機構により分泌系およびエンドサイトーシスにかかわるすべての生体膜と機能的に連携している．しかしながら，小胞体膜が膜融合するのは，小胞体膜どうし，あるいは，逆輸送にかかわるゴルジ体に由来する小胞とだけである．小胞体は，細胞膜を含め，ほぼすべてのオルガネラと物理的な接着部位を形成することが知られている．近年の研究から，これらの膜接着部位が生理学的に重要な役割をはたしていることが示唆されている．これまで，膜接着部位の機能として，Ca2+の制御，脂質など低分子の交換，小胞体に局在する酵素によるもう一方の膜に存在する基質の制御が示されている1,2)（図1）．高等真核生物において小胞体と細胞膜との接着部位は，1950年代，電子顕微鏡により筋肉細胞において確認された3)．また，小胞体-細胞膜接着部位はニューロンにおいても多く確認されている4)．そして，近年になり，小胞体-細胞膜接着部位はすべての真核生物に普遍的に存在する構造として認識されるようになった．
　後生動物においてもっとも確立された小胞体-細胞膜接着部位の機能はCa2+の制御である．筋肉においては，細胞膜に存在する電位依存性Ca2+チャネルと小胞体に局在するリアノジン受容体との共役が，細胞膜の脱分極と小胞体からのCa2+の放出を協調して制御している5)．また，小胞体-細胞膜接着部位は小胞体におけるCa2+の制御にかかわるストア作動性のCa2+流入にも重要な役割をはたしている．ストア作動性Ca2+流入は，小胞体のCa2+センサーであるSTIM1がCa2+の減少を感知し凝集することにより小胞体-細胞膜接着部位に移動し，細胞膜のCa2+チャネルであるOrai1と複合体を形成してこれを活性化させ，細胞の外からのCa2+の流入をひき起こし，小胞体におけるCa2+の濃度を正常にもどす機構である6,7)．小胞体におけるCa2+の減少は小胞体-細胞膜接着部位の面積を拡大することが知られているが，小胞体-細胞膜接着部位はSTIM1の細胞膜への移行よりまえに存在している．このことは，小胞体に局在する酵素が細胞膜に存在する基質を恒常的に制御していることと一致する．しかしながら，これらの酵素は小胞体-細胞膜接着部位に特異的に局在することはなく，小胞体-細胞膜接着部位の形成における機能はほかのタンパク質により担われているものと考えられていた．
　今回の研究において，筆者らは，光学顕微鏡による解析（スピニング共焦点顕微鏡，全反射顕微鏡，Ca2+イメージング法）と電子顕微鏡による解析，分子生物学的および生化学的な手法を組み合わせ，extendedシナプトタグミンが小胞体-細胞膜接着部位の形成に必要であり，細胞膜に存在するホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸および細胞内のCa2+に依存的に小胞体-細胞膜接着部位を制御していることをつきとめた．

1．extendedシナプトタグミンは小胞体に局在する
　出芽酵母においては50％以上の小胞体が小胞体-細胞膜接着部位を形成していることが知られている8)．近年，出芽酵母において，シナプトタグミンスーパーファミリーに属するタンパク質tricalbins（Tcb1p，Tcb2p，Tcb3p）が小胞体-細胞膜接着部位に特異的に局在し，小胞体と細胞膜との接着に重要な役割をはたしていることが示されている9)．tricalbinsは小胞体膜に局在し，その細胞質の側にSMPドメインと複数のC2ドメインをもつ．哺乳類の細胞はtricalbinsのホモログとしてextendedシナプトタグミン（E-Syt1，E-Syt2，E-Syt3）をもつ（図2）．エピトープタグとの融合タンパク質を発現させた実験から，E-Syt1は細胞質の未確認のオルガネラに局在し，E-Syt2とE-Syt3は細胞膜に局在するとされていた10)．
　筆者らは，N末端およびC末端にタグをつけた融合タンパク質を用いて，extendedシナプトタグミンの細胞内における局在を光学顕微鏡および電子顕微鏡により調べた．その結果，すべてのextendedシナプトタグミンが小胞体に局在することが示された．さらに，電子顕微鏡を用いた形態の観察により，E-Syt2あるいはE-Syt3を過剰に発現すると小胞体-細胞膜接着部位が拡大することが示された．免疫電子顕微鏡法により，E-Syt2およびE-Syt3は小胞体-細胞膜接着部位に特異的に局在することもわかった．E-Syt1は小胞体に広く局在していたが，部分的には小胞体-細胞膜接着部位に局在することも観察された．

2．extendedシナプトタグミンは疎水性の領域を小胞体膜に挿入することにより小胞体に局在する
　extendedシナプトタグミンの局在は，同じくシナプトタグミンスーパーファミリーのメンバーでありI型膜貫通タンパク質として細胞膜に存在するシナプトタグミン1（Syt1）とは大きく異なっていた11)．そのため，これらの局在を同じ条件において比較し，extendedシナプトタグミンの局在の機構について調べた．N末端にMycタグをつけたSyt1およびextendedシナプトタグミンの局在を比較した結果，Syt1のN末端は細胞外に露出していたが，extendedシナプトタグミンのN末端は細胞外に露出していないことが判明した．同様の結果は，HeLa細胞およびSH-SY5Y神経線維芽細胞においても確認された．このことから，extendedシナプトタグミンはSyt1と異なる局在の形式をもつことがわかった．
　extendedシナプトタグミンおよびSyt1はともにシグナル配列をもたないことに注目し，膜貫通部位と思われた疎水性アミノ酸配列について調べたところ，extendedシナプトタグミンのもつ疎水性アミノ酸配列の長さ（30残基あるいは31残基）はSyt1（27残基）のものより長いことが判明した．重要なことに，extendedシナプトタグミンのもつ疎水性アミノ酸配列の長さは，通常の小胞体膜タンパク質のもつ膜貫通領域（およそ20アミノ酸残基分）よりも大幅に長く，このことから，extendedシナプトタグミンの疎水性アミノ酸配列はヘアピン構造を形成していることが示唆された．また，tricalbinsのもつ疎水性アミノ酸配列もextendedシナプトタグミンと同様に長く，中央には電荷をもつアミノ酸残基をもち，ヘアピン構造を示すことにおいて一致していた．N末端に付加されたMycタグに対する抗Myc抗体のアクセス，生細胞イメージング，in vitroにおけるプロテナーゼのN末端へのアクセスについて調べた結果，extendedシナプトタグミンのN末端は細胞質の側に露出しており，疎水性の領域はヘアピン構造を形成することにより小胞体膜にアンカーされているという仮説が強く支持された（図2）．

3．extendedシナプトタグミンはC2ドメインに依存的に小胞体と細胞膜とを接着する
　C2ドメインはリン脂質結合モジュールであり，その表面に存在する塩基性パッチと酸性の脂質二重膜との結合は，細胞膜に豊富に存在するホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸により増強されることが知られている12)．細胞質の側にC2ドメインをもつという構造から，extendedシナプトタグミンはC2ドメインに依存的に小胞体-細胞膜接着部位に局在すると示唆された．E-Syt2とE-Syt3のもつC2Cドメインには塩基性パッチが保存されており，C2Cドメインを欠損させた変異体および塩基性パッチのアミノ酸残基をアラニン残基に置換した変異体は，小胞体-細胞膜接着部位への局在を失うことが判明した．また近年，筆者らの研究室において開発された青色光に依存的に細胞膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸を操作する方法13) を用いた結果，ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸を急激に減少させたときにもE-Syt2およびE-Syt3の小胞体-細胞膜接着部位への局在は失われることが判明した．
　C2ドメインのサブセットにはCa2+結合部位をもちCa2+に依存的に脂質二重膜に結合するものがある14)．extendedシナプトタグミンのもつC2ドメインの構造を比較した結果，E-Syt1のC2CドメインはCa2+結合部位をもつことが確認された．このことから，E-Syt1の小胞体-細胞膜接着部位への局在は細胞内におけるCa2+濃度の上昇により制御されていることが示唆された．そして実際に，E-Syt1は細胞内におけるCa2+濃度の上昇により小胞体-細胞膜接着部位に移行することが確認された．さらに，このCa2+濃度の上昇に依存的なE-Syt1の移行は，細胞膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸に依存することが示された．

4．extendedシナプトタグミンが互いにヘテロ複合体を形成することにより小胞体-細胞膜接着部位の制御がCa2+に依存的となる
　生化学的な手法により，extendedシナプトタグミンはホモ複合体およびヘテロ質複合体を形成することがつきとめられた．よって，extendedシナプトタグミンにより形成される小胞体-細胞膜接着部位は，E-Syt1のもつCa2+との結合能を介してCa2+により制御されていることが示唆された．extendedシナプトタグミンを過剰に発現しない条件においても，細胞内のCa2+濃度の上昇に依存して小胞体が細胞膜に近接し小胞体-細胞膜接着部位を形成することが示された．これらの生化学的な手法，光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いた形態の観察により，extendedシナプトタグミンにより形成される小胞体-細胞膜接着部位は，細胞膜に存在するホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸および細胞内のCa2+により制御されていることが明らかになった．

5．extendedシナプトタグミンにより形成される小胞体-細胞膜接着部位はSTIM1およびOrai1により形成される小胞体-細胞膜接着部位とは機能的に異なる
　extendedシナプトタグミンの生理的な役割を調べるため，RNAi法によりその発現をノックダウンした．3つすべてのextendedシナプトタグミンをノックダウンしたHeLa細胞において，小胞体-細胞膜接着部位が有意に減少していることが光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いた形態の観察により確認された．また，このトリプルノックダウン細胞においては細胞内のCa2+濃度の上昇による小胞体-細胞膜接着部位の形成はみられなかった．
　これまでもっともくわしく研究されてきた小胞体-細胞膜接着部位の機能のひとつは，小胞体のCa2+センサーであるSTIM1および細胞膜のCa2+チャネルであるOrai1による細胞外からのCa2+の流入である（ストア作動性Ca2+流入）．Fura2を用いたCa2+イメージング法によりextendedシナプトタグミンのトリプルノックダウン細胞におけるストア作動性Ca2+流入について調べた結果，ストア作動性Ca2+流入のピークは対照と比べ変化のないことが判明した．電子顕微鏡を用いた形態の解析により，これまでストア作動性Ca2+流入に必要であると示唆されていた薄小胞体（thin ER）は15)，extendedシナプトタグミンのトリプルノックダウン細胞においても形成されていることが判明した．これらの結果から，extendedシナプトタグミンにより形成される小胞体-細胞膜接着部位は，STIM1およびOrai1により形成される小胞体-細胞膜接着部位とは機能的に異なることが判明した．

おわりに
　シナプトタグミンスーパーファミリーに属するタンパク質は，Syt1をはじめ，シナプス小胞を含めた分泌小胞の膜融合において重要な役割をはたすことが知られていたが，今回の筆者らの研究により，extendedシナプトタグミンが小胞体と細胞体との接着部位の形成にかかわることが示された（図3）．しかしながら，extendedシナプトタグミンが小胞体-細胞膜接着部位においてどのような役割をはたしているかに関しては依然として不明な点が多い．extendedシナプトタグミンはこれまであまり研究されていないSMPドメインを介して小胞体膜および細胞膜における脂質の交換などをつかさどっている可能性がある．あるいは，小胞体-細胞膜接着部位に局在する新規のタンパク質とのタンパク質複合体として機能をはたしているのかもしれない．extendedシナプトタグミンおよびtricalbinsの解析は，小胞体と細胞膜とのコミュニケーションをつかさどる進化学的に保存された分子機構の解明への第一歩となることであろう．

〈文 献〉
 1) Elbaz, Y. & Schuldiner, M.: Staying in touch: the molecular era of organelle contact sites. Trends Biochem. Sci., 36, 616-623 (2011)
 2) Stefan, C. J., Manford, A. G. & Emr, S. D.: ER-PM connections: sites of information transfer and inter-organelle communication. Curr. Opin. Cell Biol., DOI: 10.1016/j.ceb.2013.02.020
 3) Porter, K. R. & Palade, G. E.: Studies on the endoplasmic reticulum. III. Its form and distribution in striated muscle cells. J. Biophys. Biochem. Cytol., 3, 269-300 (1957)
 4) Rosenbluth, J.: Subsurface cisterns and their relationship to the neuronal plasma membrane. J. Cell Biol., 13, 405-421 (1962)
 5) Endo, M.: Calcium-induced calcium release in skeletal muscle. Physiol. Rev., 89, 1153-1176 (2009)
 6) Hogan, P. G., Lewis, R. S. & Rao, A.: Molecular basis of calcium signaling in lymphocytes: STIM and ORAI. Annu. Rev. Immunol., 28, 491-533 (2010)
 7) Carrasco, S. & Meyer, T.: STIM proteins and the endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions. Annu. Rev. Biochem., 80, 973-1000 (2011)
 8) West, M., Zurek, N., Hoenger, A. et al.: A 3D analysis of yeast ER structure reveals how ER domains are organized by membrane curvature. J. Cell Biol., 193, 333-346 (2011)
 9) Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L. et al.: ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Dev. Cell, 23, 1129-1140 (2012)
10) Min, S. W., Chang, W. P. & Sudhof, T. C.: E-Syts, a family of membranous Ca2+-sensor proteins with multiple C2 domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 3823-3828 (2007)
11) Sudhof, T. C.: Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 4, a011353 (2012)
12) Rizo, J. & Sudhof, T. C.: C2-domains, structure and function of a universal Ca2+-binding domain. J. Biol. Chem., 273, 15879-15882 (1998)
13) Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B. et al.: Optogenetic control of phosphoinositide metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, E2316-E2323 (2012)
14) Fernandez, I., Arac, D., Ubach, J. et al.: Three-dimensional structure of the synaptotagmin 1 C2B-domain: synaptotagmin 1 as a phospholipid binding machine. Neuron, 3, 1057-1069 (2001)
15) Orci, L., Ravazzola, M., Le Coadic, M. et al.: From the Cover: STIM1-induced precortical and cortical subdomains of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 19358-19362 (2009)

〈著者プロフィール〉
佐伯 恭範（Yasunori Saheki）
略歴：2010年 米国Rockefeller大学大学院博士課程 修了，同年より米国Yale School of Medicineポスドク．
研究テーマ：神経変性疾患の病態の機構．
抱負：基礎医学の観点から生物学の深みをみていきたい．

Pietro De Camilli
米国Yale School of MedicineにてProfessor．
研究室URL：http://medicine.yale.edu/labs/decamilli/www/Home.html

〈図説明〉
図1　小胞体と細胞膜は物理的な接着部位を形成する
小胞体は機能的に分泌系およびエンドサイトーシス経路とつながっており，細胞膜を含む種々の生体膜と物理的な接着部位を形成することが知られている．その機能としてはCa2+の制御がよく知られているが，そのほかにも，脂質組成の制御やシグナル伝達に重要な役割をはたしている．
図2　extendedシナプトタグミンはヘアピン構造を形成することにより小胞体膜に挿入している
I型膜貫通タンパク質であるSyt1に対し，extendedシナプトタグミン，E-Syt1，E-Syt2，E-Syt3は，その疎水性の領域がヘアピン構造を形成して小胞体膜に挿入することにより小胞体に局在する．extendedシナプトタグミンのもつ疎水性の領域はSyt1のものよりも長く，このことはヘアピン構造の挿入と一致している．
黄色：疎水性の領域，ピンク色：SMPドメイン，水色：C2ドメイン．
図3　extendedシナプトタグミンは細胞膜に存在するホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸および細胞内のCa2+濃度の上昇に依存的に小胞体-細胞膜接着部位を制御する
分泌小胞に局在し，細胞膜との融合（エキソサイトーシス）を誘導するSyt1に対し，extendedシナプトタグミンは小胞体に局在し，小胞体と細胞膜との接着部位を制御する．Syt1およびextendedシナプトタグミンはともに，細胞膜に存在するホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸および細胞内のCa2+濃度の上昇に依存的にこれらの過程を制御する．
黄色：SMPドメイン，水色：C2ドメイン．