<スタンダードSDS-PAGE>
1)1mmスペーサー付きガラス板(160×140×1mm)、シリコンチューブ、耳付きガラス板を組立て、
大型クリップで4箇所を止め、実験台の上に立てる。
2)100 mlビーカー中で分離ゲル溶液を調製する。
分離ゲルの組成 |
15%(1枚分) |
分離ゲル用アクリルアミド溶液
分離ゲル用緩衝液
純水
10%過硫酸アンモニウム
TEMED
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8.5 ml
6.3 ml
2.0 ml
120 µl
20 µl
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泡立てないように撹拌し、組立てたガラス板の間に上から約3cmの高さまで注入する
(10%過硫酸アンモニウムとTEMEDを入れるとすぐ固まるので素早く行う)。
3)約1mlの純水をピペットマン等で、ゲルに重層する。
4)室温で40分〜1時間放置して、ゲル化させる。
5)水をとりのぞく。
6) 100 mlビーカー中で濃縮ゲル溶液を調製する。
濃縮ゲルの組成 |
5%(1枚分) |
濃縮ゲル用アクリルアミド溶液
濃縮ゲル用緩衝液
純水
10%過硫酸アンモニウム
TEMED
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1 ml
3 ml
2 ml
30 µl
20 µl
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泡立てないように撹拌して、分離ゲルの上に重層し、コームを挿入する
(10%過硫酸アンモニウムとTEMEDを入れるとすぐ固まるので素早く行う)。
7)室温で20分間放置する。
8)コームを抜き、クリップ、シリコンチューブをはずす。
9)試料溝の部分の未重合アクリルアミドを注射器等で除く。
10)ガラス板を泳動槽にセットして、泳動用緩衝液を満たす。
11) 試料用緩衝液に溶解し、95℃、3分間熱処理した試料を、マイクロシリンジや
ピペットマンで試料溝に注入する。少量のBPB溶液(50μl)を陰極側電極槽(上層)に添加する。
12)35 mA(定電流)で、BPBがゲルの下部から約5mmのところへ移動するまで泳動する(約3時間)。
13)電流を切って、ガラス板を泳動槽から取りはずす。
14)スパチュラを用いて、耳付きガラス板をはずす。
15)分離ゲルと濃縮ゲルの間を切り、分離ゲルをクマシーブリリアントブルー染色液にて30分間染色する。
16)脱色液中で脱色する。
<アラビアゴム乾燥>
1)ゲル上のタンパク質を染色したのち、ゲルを水洗し、20%アラビアゴムに浸し1時間放置する。
2)セロファンを10%グリセリンに浸し、アクリル板上にのせる
(セロファンとアクリル板の間の気泡をできるだけ除く)。
3)この上にゲルをのせ、少量の10%グリセリンをかける(ゲルとセロファンの間の気泡を完全に除く)。
4)その上に、気泡が入らないようにセロファンをかけ、アクリル板をのせてクリップで止める。
5)板を立てたまま、50℃・8時間以上乾燥器に入れる。
6) 乾燥したゲルはアクリル板からカッター等ではずす。
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