エレクトロエリューション法と透析法

<エレクトロエリューション法>

  1) ゲルの切り出し
   二次元電気泳動後、染色・脱色したゲルから目的のタンパク質のスポットを切り出す。
     ライトボックス上でスパチュラを用いて切り出しを行い、純水で洗浄後、
     水分を除いてエッペンチューブに入れる。このまま冷凍保存可能(-20℃)。
  2) ゲルの入ったエッペンチューブに、電極液を750μl入れ、パラフィルムを巻き、30分振とう。
 3) その間にビーカーに沸騰した超純水を入れ、透析膜を入れ5分間位煮沸する。
 4) ビーカーに超純水を入れ、セロファンを浸し、回収カップAの部分にリングでとめてセットする。
5) 透析膜をとりだし、片側を広げておく。 6) その逆側を折って、オレンジピンでもれない様にしっかり止める。 7) リングを透析膜にはめ込み、Bの部分にセットする。  8) 30分揺らしておいたサンプルをA方に全部移す。   (この時バッファー層に回収カップをセットしておく。) 9) バッファー層に電極液を左右に入れる。 10) 回収カップの中にも電極液を入れて満たす。 11) ふたをして、電源をつなぎ100Vで2時間泳動する。
<透析法> 1) 2時間後電源を切る。   (この時CBBの青色が移動した状態)A→B 2) 回収カップの中の余分な電極液(A側)を吸いとる。 3) 回収カップを持ち上げて、リング大をはずしとり、中に空気を少し入れ口を折り曲げて、 オレンジピンでもれないようにとめる。 4) 5l用ガラスビーカーに純水を3l位用意し、3)を入れて低温室で約2日間、スターラーで弱く回す。   (超純水を1日3〜4回こまめにとりかえる) 5) 透析したサンプルを2mlエッペンチューブ数本に分注し、ナンバリングしておく。 6) 専用針でふたに穴を開け、スピードバックコンセトレーターでオーバーナイトで乾燥。 7) 各サンプルにつき、1本目のチューブに試料用緩衝液を20μl入れ、 壁に付いているサンプルをできるだけ落として、20〜30回ピペッティングし、サンプルを溶解する。 8) サンプル液を次のチューブに移し、順番に洗い最後の1本に集めておく。 9) チップは又使うので最後のチューブの中に入れておく。更に、試料用緩衝液10µlで、 1チューブの管壁を洗い、同様に最後の1本に移していく。